Comparação de diferentes protocolos para a detecção do vírus da diarréia viral bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sangüíneo, artificialmente contaminados

Autores

  • Daniela Pilz Universidade Estadual de Londrina
  • Alice F. Alfieri Universidade Estadual de Londrina
  • Amauri A. Alfieri Universidade Estadual de Londrina

DOI:

https://doi.org/10.5433/1679-0359.2005v26n2p219

Palavras-chave:

Bovino, Diarréia viral bovina, BVDV, RT-PCR, Soro sangüíneo.

Resumo

A técnica da RT-PCR foi otimizada e avaliada para a detecção da região 5’ terminal não-traduzida do genoma do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em amostras clínicas de bovinos, constituídas por soro sangüíneo e sangue total, artificialmente contaminadas com a estirpe NADL do BVDV. Para a otimização da técnica foram avaliados: i) dois pares de primers, 103 / 372 (WEINSTOCK et al., 2001) e 324 / 326 (VILCEK et al., 1994) ii) quatro métodos de extração do ácido nucléico (fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; sílica / isotiocianato de guanidina; uma combinação dos dois métodos anteriores e TRIzol™) e iii) diferentes concentrações e composições de reagentes, tampões e tempo/temperatura das reações. Entre todas as alternativas testadas a que resultou na amplificação de um produto com 290 pb, que foi facilmente visualizado em gel de agarose 2% com brometo de etídeo, foi a que empregou as seguintes condições: i) primers 103 e 372; ii) volume inicial e amostra clínica: 50 mL de soro sangüíneo; iii) extração do ácido nucléico: método da sílica / isotiocianato de guanidina, iv) transcrição reversa: 9 mL do ácido nucléico extraído, 1xPCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 e 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 60 unidades da enzima transcriptase reversa M-MLV, desnaturação do RNA a 97°C / 4 min e transcrição reversa a 42°C / 30 min e v) PCR: primers 103 / 372 com temperatura de anelamento de 59°C. A utilização da RT-PCR nas condições otimizadas nesse estudo possibilitou a amplificação da estirpe NADL do BVDV (103,56 TCID50) em pools, artificialmente contaminados, de soro sangüíneo de bovinos até a diluição de 1:160.

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Biografia do Autor

Daniela Pilz, Universidade Estadual de Londrina

Aluna do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal; Nível: Mestrado), Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Estadual de Londrina (UEL).

Alice F. Alfieri, Universidade Estadual de Londrina

Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, CCA, UEL, Campus Universitário, caixapostal 6001, CEP. 86051-990, Londrina, Paraná, Brasil.

Amauri A. Alfieri, Universidade Estadual de Londrina

Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, CCA, UEL, Campus Universitário, caixapostal 6001, CEP. 86051-990, Londrina, Paraná, Brasil.

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Publicado

2005-06-30

Como Citar

Pilz, D., Alfieri, A. F., & Alfieri, A. A. (2005). Comparação de diferentes protocolos para a detecção do vírus da diarréia viral bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sangüíneo, artificialmente contaminados. Semina: Ciências Agrárias, 26(2), 219–228. https://doi.org/10.5433/1679-0359.2005v26n2p219

Edição

Seção

Artigos